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產(chǎn)品介紹

本試劑盒采用CBA多因子流式檢測(cè)技術(shù)，微球熒光編碼不同，不同微球群上包被TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17特異性抗體，與待測(cè)樣本孵育，可與樣本中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17特異性結(jié)合，之后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，形成抗體包被微球-細(xì)胞因子-檢測(cè)抗體的免疫復(fù)合物；最后加入藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，與生物素結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，獲得待測(cè)物的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與樣本中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17的含量成正比，最后結(jié)合這十種細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)同一份樣本中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17的定量檢測(cè)。從而輔助判斷機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。

預(yù)期用途

檢測(cè)人體血清血漿和培養(yǎng)上清中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17的表達(dá)水平。

試劑盒組成

注：試劑盒中不包括，但試驗(yàn)需要的材料：流式管， 15 mL 離心管， 1. 5 mL EP 管，錫箔紙，磁力板。

適用機(jī)型：本品適用于市面上的大多數(shù)有PE和APC通道的流式細(xì)胞儀。

樣本要求：

血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清：建議4-6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，如無法及時(shí)檢測(cè)請(qǐng)-20℃凍存，忌反復(fù)凍融。

檢驗(yàn)方法

1. 洗液緩沖液（1×)的準(zhǔn)備

顛倒混合標(biāo)有20×洗液的瓶子。在475 mL蒸餾水中加入20×洗液25 mL，并輕輕混合以免起泡沫。儲(chǔ)存于2～8℃待用。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品制備（準(zhǔn)備8個(gè)1.5 mLEP管分別編號(hào)1.2.3.4.5.6.7.8 ）

2.1使用前按照下表將各因子的標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液溶解，充分混勻，室溫放置10分鐘，分別從每管中取出20 μl混合，此管將被用作標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度1號(hào)管（5000pg/ml）。

2.2 其他7個(gè)（2～8 號(hào)）EP管中分別加入150 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液，準(zhǔn)備梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 在1號(hào)管中轉(zhuǎn)移50 μL標(biāo)準(zhǔn)品到2號(hào)管充分混勻，再在2號(hào)管轉(zhuǎn)移50 μL到3號(hào)管充分混勻。以同樣方式依次連續(xù)稀釋到7號(hào)管。

3. 捕獲微球預(yù)處理

確定實(shí)驗(yàn)孔數(shù)（包括標(biāo)準(zhǔn)品和樣本），計(jì)算所需捕獲微球混合液的用量。例如：待測(cè)樣本88個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)品8個(gè), 共計(jì)96孔。每個(gè)孔需要捕獲微球混合液50 μL。我們可以按100孔的量進(jìn)行微球混合，需取5000 μL捕獲微球混合液。（注意：需將捕獲微球渦旋20 s，充分混勻后再取）

4. 樣本處理

建議對(duì)于血清或血漿樣本需使用標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液進(jìn)行2倍稀釋。

表1

5. 操作步驟

*實(shí)驗(yàn)前將所有試劑取出平衡至室溫；

*實(shí)驗(yàn)過程中，包括清洗步驟，將板子始終水平放置，以免珠子丟失；

*孵育過程中，板子應(yīng)注意避光。

5.1 從梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品1-8號(hào)管中分別取出50 μL移入對(duì)應(yīng)的96孔板孔中。

5.2 其余樣本孔每孔加入稀釋好的血清或血漿樣本50 μL。

5.3 渦旋微球20 s，每孔加入50 μL微球，現(xiàn)每孔體積應(yīng)為100 μL/孔。（加微球過程中應(yīng)隨時(shí)渦旋微球管，避免微球沉降，建議每加1-8個(gè)孔，渦旋混勻一次微球）。

5.4 將96孔板用封板膜封上，放到搖床上450 rpm/min混勻5min，然后放到37℃, 孵育30min。

5.5 將96孔板卡在磁力板上5 min，去除上清。

5.6 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入200μL洗液。再將96孔板放在磁力板上5 min，去除上清。

5.7 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100μL檢測(cè)抗體。

5.8 將96孔板用封板膜封上，放到搖床上450 rpm/min混勻5min，然后放到37℃, 孵育30min。

5.9 重復(fù)步驟5.5-5.6。

5. 10 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100μL藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素。

5. 11 將96孔板用封板膜封上，放到搖床上450 rpm/min混勻5min，然后放到37℃, 孵育15min。

5. 12 重復(fù)步驟5.5-5.6。

5. 13 每孔加入200μL洗液重懸樣本，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

6. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

6.1 微球群分布 ：

表2

注：微球內(nèi)部用不同強(qiáng)度的熒光染料染色。

6.2 模板建立：

建立X軸為FSC、Y 軸為SSC的線性散點(diǎn)圖模板，設(shè)定混合微球位置，如說明書圖1；

建議兩個(gè)PE（X軸）和APC的對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖模板，分別顯示R1門或R2門內(nèi)微球，使得所有的微球群能夠清楚和明顯的分布于散點(diǎn)圖上，顯示各因子PE熒光強(qiáng)度。如說明書圖2，圖3。調(diào)節(jié)PE PMT電壓，使所有微球群左側(cè)不壓線，右側(cè)位于PE軸檢測(cè)范圍內(nèi)（說明書圖2,3）。

6.3 樣品的檢測(cè)結(jié)果分析

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本依次上機(jī)檢測(cè)，對(duì)于每種微球群，應(yīng)最少獲取100個(gè)微球。利用標(biāo)準(zhǔn)品梯度作標(biāo)曲，計(jì)算樣本檢測(cè)結(jié)果。

7. 軟件分析

用FCAP軟件進(jìn)行分析

參考區(qū)間

用十項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(流式熒光發(fā)光法)檢測(cè)150例健康者，得到正常參考值：IL-1β ≤3.4 pg/mL、IL-2≤11.4 pg/mL、 IL-4≤12.9 pg/mL、 IL-6≤20 . 1 pg/mL 、 IL-8≤15.71 pg/mL 、 IL-10≤5.9 pg/mL、 IFN-γ≤15. 1 pg/mL、TNF-α≤6 . 1 pg/mL、IL-12p70≤10. 18 pg/mL、IL-17≤ 8. 57pg/mL（由于環(huán)境、性別、年齡等差異，此數(shù)據(jù)僅供參考）。

檢測(cè)結(jié)果的解釋

1. 待檢測(cè)樣本細(xì)胞因子的測(cè)定在表3檢測(cè)范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果有效，可直接報(bào)告測(cè)定結(jié)果；若檢測(cè)結(jié)果超出檢測(cè)范圍,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品/樣品/微球稀釋液將樣本稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)重新檢測(cè)；若待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)下限或未檢測(cè)到，則直接報(bào)告為≤最低檢測(cè)值。

表3

2. 建議：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)揭示和出具報(bào)告的實(shí)驗(yàn)人員需經(jīng)過正規(guī)的技術(shù)培訓(xùn)。

檢驗(yàn)方法的局限性

不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、處理以及儀器的設(shè)置不當(dāng)均有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。

產(chǎn)品性能指標(biāo)

1. 外觀和性狀

試劑盒各組份應(yīng)齊全、完整，液體無滲漏；外包裝應(yīng)完整、無破損，標(biāo)簽應(yīng)清晰、易識(shí)別。

2. 裝量

應(yīng)符合要求，不低于標(biāo)示值。

3. 準(zhǔn)確度

使用本試劑盒檢測(cè)已知濃度的樣本，其檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差在±15%以內(nèi)。

4. 重復(fù)性

本試劑盒檢測(cè)TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17變異系數(shù)（CV）應(yīng)≤15%。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒僅用于科研，不用于臨床診斷。

2. 實(shí)驗(yàn)樣本、質(zhì)控/標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)廢棄物等材料應(yīng)當(dāng)作為潛在傳染物進(jìn)行處理，并且采用符合法規(guī)的預(yù)防措施對(duì)其處理。

3. 流式細(xì)胞儀未經(jīng)正確校準(zhǔn)、熒光滲漏未進(jìn)行合理補(bǔ)償以及檢測(cè)區(qū)域（設(shè)門）未精確定位，則可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。請(qǐng)參考該儀器操作規(guī)程進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器在使用前處于最佳檢測(cè)狀態(tài)。

4. 本品含熒光素，切勿直接接觸皮膚或沾染食物，操作時(shí)務(wù)必戴手套操作。

5. 標(biāo)準(zhǔn)品在配成溶液后，請(qǐng)?jiān)?0小時(shí)內(nèi)使用。

6. 在使用之前，捕獲微球混合液必須充分的振動(dòng)混合。

7. 為確保熒光檢測(cè)質(zhì)量，凡涉及檢測(cè)抗體的相關(guān)步驟都需避光操作。

8. 不同批號(hào)的試劑請(qǐng)勿混用，并請(qǐng)?jiān)谟行诜秶鷥?nèi)使用。